提到结核病，大家都不陌生，它是全球最常见的传染病之一，历史上，很多名人都是死于结核病，如肖邦、契诃夫、席勒、梭罗、雪莱、鲁迅、林徽因等等。时至今日，结核病仍严重威胁着人类的健康和生命安全。据世界卫生组织（WHO）“全球结核病年报”报告，结核病从年起就超越艾滋病（HIV）成为全球第一传染病杀手。
结核分枝杆菌（MTB）是引发结核病的元凶，是一种革兰氏阳性菌，抗酸染色呈红色，专性需氧，最适温度为37℃，低于30℃不生长。结核分枝杆菌有3个培养特性：馋、懒、丑。
馋营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏）上才能生长良好；
懒生长缓慢，12～24h分裂1次，在固体培养基上2～4w才出现肉眼可见的菌落，因此也给科学研究带来了一定的困难；
丑典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。
MTB是非常古老的细菌，与人类的起源一样，MTB的起源可追溯到万年前的非洲大陆，并且伴随着7万年前人类的大迁移“走出非洲”，传播至全球各地。经过漫长的自然选择，MTB号称目前世界上进化最成功的细菌：
首先，他具有极强的传染性强，可通过空气、食物以及母婴传播;
其次，他是一种胞内寄生菌，藏在宿主细胞中，并且皮厚油多，药物难于抵达，不易杀灭，治疗周期长，极易产生耐药；
另外，他还具有极强的潜伏性，应该是世界上长得最慢的细菌（约1天传一代）；
世界上大约三分之一的人（超过20亿）有潜伏性结核，这些人中有5-10%将在未来发展为活动性结核，潜伏期无症状、不传染，当人体抵抗力低下时会转变成活动性结核菌。
结核分枝杆菌属于一个大的群体——结核分枝杆菌复合群（MTBC）。这些MTBC成员在核酸水平序列的相似性超过99%，具有完全相同的16SrRNA序列，且基因组上无大的基因组结构重排、倒位或转置。尽管MTBC菌株之间基因组序列相似性非常高（99%以上），但是其表型（如致病性、宿主适应性等）却有着较大的差异，这可能是由于MTBC菌株与宿主之间长期的共进化导致的，长期的地理隔离导致了基因型的隔离，进一步造成了MTBC表型的差异：如非洲分枝杆菌主要在非洲人中引起结核病，田鼠分枝杆菌主要导致田鼠和啮齿类动物的结核病，牛型分枝杆菌主要引起牛结核病。
MTBC如此保守的基因组却有着如此差异显著的表型（图1），
那么其成员在基因组水平到底存在怎样的差异？
除了基因组DNA序列层面的不同，是否存在其它层面的原因决定了MTBC成员菌之间功能表型的巨大差异？
为了探索MTBC致病性以及表型差异的遗传基础，我们选取了分属不同谱系、适应于不同宿主且表现出不同致病性的12株MTBC菌株（牛分枝杆菌、卡介苗、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、6株临床结核分枝杆菌，以及结核分枝杆菌标准株H37Rv和H37Ra各1株），利用PacBio第三代单分子实时测序技术（SMRT），从比较基因组学和表观基因组学两个角度出发，对MTBC展开了系统的分析。图1：MTBC保守的基因型和差异显著的表型
首先，我们从与结核分枝杆菌致病性最相关的宿主适应性、毒力和免疫三个角度出发，通过比较基因组学的分析，发现了导致MTBC致病性和宿主差异的基因组变异（图2）：
宿主适应性烯酰辅酶A水合酶、PE/PPE家族蛋白和mce3家族蛋白等三类基因只存在于人源菌株中，可能是导致MTBC宿主适应性差异的直接原因；
毒力
13个毒力因子在强毒力北京系中存在突变；IM（EspK）等3个位点突变，导致Mtb有毒株H37Rv与同源无毒株H37Ra的毒力差异；RD1区域的前4个基因，对动物源MTBC的毒力至关重要；
免疫北京系菌株特异缺失了4个抗原决定簇，可能导致北京系菌株的免疫逃逸，使其感染性更强；不同宿主的MTBC在抗原决定簇上也存在差异，反应了不同宿主的结核杆菌与相应宿主之间特异的免疫反应
图2：导致MTBC表型差异的基因组变异
除了MTBC基因组DNA序列层面的不同之外，MTBC成员菌之间在表观遗传修饰上是否存在差异呢？
为了探究这一问题，我们进一步利用PacBioSMRT对MTBC的全基因组甲基化图谱进行了全景式解析。我们共鉴定到了3种MTBC中特有的6-mA甲基化motifGATN4RTAC、CTCCAG和CACGCAG及相对应的甲基转移酶——HsdM、MamA和MamB，并通过实验验证了上述酶的活力（图3）。
其中MamB为我们新发现的IIG甲基化酶，其对应的甲基化motif为CACGCAG，HsdM的甲基化motif也是首次被报道，为GATN4RTAC。通过对甲基化motif分布特征的分析发现，GATN4RTAC更倾向于分布在基因间区，并且在距离起始密码子前70-80bp的位置有明显的富集，对MTBC启动子区域的分析发现，该区域与启动子区域重合，暗示其可能行使表观调控的作用。进一步对甲基化酶的多序列比对，我们还发现了导致甲基化酶失活的基因突变或缺失。
图3：MTBC甲基化组特征
我们还通过深入挖掘PacBio三代测序所获得的数据，借助于对单位点甲基化比例的计算，得到了MTBC的精准甲基化图谱。此外，我们也发现了一个十分有趣的现象：在MTBC甲基化组中存在着大量的“未甲基化”（unmethylated，即基序位点DNA双链均未被甲基化修饰）及“半甲基化”（hemi-methylated，即基序位点DNA双链之一未被甲基化修饰）motif，说明细菌的基因组DNA甲基化也可能如真核生物细胞DNA甲基化一样具有复杂的调控机制。进一步对这些未甲基化和半甲基化motif的分析发现，绝大多数motif位点与拟核蛋白或转录因子结合区域重合，我们推测这些蛋白的存在阻碍了甲基化酶的结合，从而导致相应位点的未甲基化或半甲基化（图4）。
图4：MTBC6-mA表观遗传调控假说
这一课题是我们医院共同合作完成的，虽然我们仅从事结核病的基础研究，而不在临床第一线治疗病人，但是一想到我们的研究成果将来有可能应用到临床，期间经历的所有辛苦都值得。点击左下角的"阅读原文"可以获取已发表的文章。
回想起博士阶段的这三年，从一开始的无所畏惧，到心有余而力不足的无奈和灰心，再到得到结果后的兴奋和喜悦，这一路我收获满满。非常感谢我的导师陈非老师的悉心指导，感谢陈非老师课题组的大家的鼓励和支持。科研不同于其他工作，它有太多的未知和不确定性，我们不知道最终会得到怎样的结果，我们有时候甚至不知道该用什么样的方法，我们尝试N多次以后可能仍然会面临失败，但只要有一次成功，足矣！这也正是科研的魅力所在，探索无法预期的未知的世界。很多时候，爸妈不理解我到底在干什么，他们不明白为什么每次打电话我都在实验室，不明白为什么我一直在说做课题却总也不知道什么时候能做完。是啊，这是一个漫长的过程，漫长到自己没办法估计；这也是一个非常艰辛的过程，艰辛到自己都想要放弃。但是，这个过程中总会有志同道合的人给你加油打气、出谋划策，总会有老师不断的指点让你醍醐灌顶、豁然开朗，因此必须要耐得住寂寞，静得下性子，并且坚持不懈。就是这样的一个过程，我们这一群人却乐在其中，期待科研带给我们的惊喜，并期待着在未来的某个时间自己的研究成果能够造福于社会。
文字：贾鑫淼
图片：贾鑫淼、李翠丹、张祥丽
主编：袁慎立
审核：王彩平
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