摘要：目的制备马钱子总碱（TASS）-白芍总苷（TGP）脂质立方液晶纳米粒（TASS-TGPLLCN），并考察其体外经皮吸收行为。方法运用前体注入法制备TASS-TGPLLCN，采用超滤离心法测定包封率，以包封率为指标采用均匀设计优化TASS-TGPLLCN处方，并对优化后制备的TASS-TGPLLCN基本性能进行评价。同时，采用泊洛沙姆（F）作为凝胶基质制备凝胶，运用Franz扩散池法比较TASS-TGPLLCN凝胶和TASS-TGP普通凝胶的体外经皮渗透特性，初步考察TASS-TGPLLCN凝胶的经皮渗透行为。结果TASS-TGPLLCN的最佳制备处方为甘油单油酸酯（GMO）1.0g，F0.25g，分散相60mL，马钱子碱、士的宁及芍药苷包封率均大于50%，制剂质量评价显示制得的纳米粒平均粒径为（.3±16.4）nm，pH值6.62，在透射电镜下呈立方体结构，大小均一；透皮实验显示，TASS-TGPLLCN凝胶的24h累积透过量、渗透速率及皮肤滞留量均大于TASS-TGP普通凝胶。结论TASS-TGPLLCN呈现促渗和皮肤贮库的双重效应，具有潜在的开发前景。
马钱子始载于《本草纲目》，古人多为外用，用于痈疽初起、瘰疬结核及关节肿痛等。马钱子的主要成分为生物碱，质量分数约1.5%～5%，马钱子碱和士的宁既是有效成分也是有毒成分，约占马钱子总生物碱（马钱子总碱，totalalkaloidsofStrychniSemen，TASS）的70%[1-2]。白芍为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactifloriaPall.的干燥根，味苦、酸、性微寒，归肝经，功能平肝止痛、养血收阴。白芍总苷（totalglucosidesofpaeony，TGP）为其主要的药效成分[3]。
“中医外治”法是治疗疼痛、炎症等风湿痹症最常用、最有效的给药方式之一。马钱子、白芍均具有较强的抗炎作用，在现代治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎等风湿痹症的外用药物制剂中常配伍应用[4]。课题组前期研究结果显示，马钱子与白芍配伍经皮给药呈现一定的“增效减毒”效应[5]。
脂质立方液晶纳米粒（lipid-basedcubicliquidcrystallinenanoparticles，LLCN）是指两亲性脂质在水中自发组装形成的含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状（海绵状）”结构，独特的内部结构使其具有多样化的包裹性，能够同时包封水溶性、脂溶性及两亲性药物分子[6]。但研究多集中于对单一成分的包封[7-15]，近年来出现了对多种混合成分的包封，但也多为溶解性质相似或同类型成分[16-17]。目前，尚未见亲水亲脂复合型液晶纳米粒的文献报道。本实验尝试将TASS及TGP同时包封于LLCN中，制备成亲水亲脂复合型液晶纳米凝胶，对其新剂型进行制剂学研究及经皮转运行为评价，旨在建立马钱子总碱-白芍总苷脂质立方液晶纳米粒（TASS-TGPLLCN）的制备方法，同时开展体外透皮行为比较，为含马钱子新制剂的开发奠定基础。
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；色谱柱为GiminiC18（mm×4.6mm，5μm），美国Phenomenex公司；BSAS万分之一及BT25S十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；EPED超纯水仪，南京易普易达科技发展有限公司；ZNCL-BS智能磁力搅拌器，西安安泰仪器科技有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新艺超声设备有限公司；Nano-S激光纳米粒度仪，美国马尔文公司；TecnaiG2透射电子显微镜，美国FEI公司；TT-6DFranz扩散池，天津正通科技有限公司；TK-20B透皮扩散试验仪，上海鍇凯科技贸易有限公司。
1.2试药
TASS提取物，自制，经HPLC测定，马钱子碱质量分数为16.97%、士的宁质量分数为34.05%；TGP提取物，自制，经HPLC测定，芍药苷质量分数为52.84%；聚乙二醇（PEG），西陇化工股份有限公司；泊洛沙姆（F），BASF公司，批号WPMIB；马钱子碱对照品，50mg/支，质量分数98%以上，江西本草天工有限公司，批号BCTG-；士的宁对照品，50mg/支，质量分数98%以上，江西本草天工有限公司，批号BCTG-；芍药苷对照品，20mg/支，质量分数以95.2%计，中国食品药品检定研究院，批号-；甘油单油酸酯（GMO），西亚试剂有限公司，质量分数大于99%；磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；庚烷磺酸钠，色谱纯，上海展云化工有限公司；无水乙醇，分析纯，西陇科学股份有限公司；甲醇及乙腈，色谱纯，美国Tedia公司。
1.3实验动物
清洁级KM小鼠，雄性，体质量为18～22g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘）-。
2方法与结果
2.1TASS-TGPLLCN的制备
精密称取适量GMO于50mL烧杯中，分别加入处方量的TASS及无水乙醇溶液20mL，超声处理15min，使其充分溶解，作为A相；精密称取适量F于mL烧杯中，分别加入处方量的TGP及超纯水适量，超声15min，使其充分溶解，作为B相；将A相缓缓滴加至B相中，以r/min转速于50℃下磁力搅拌3h，再于细胞超声破碎仪上超声破碎5min（超声功率为W，5s/次，每次间隔5s），即得TASS-TGPLLCN。
2.2TASS-TGPLLCN含量测定方法的建立
2.2.1马钱子碱及士的宁混合对照品溶液的制备精密称取马钱子碱及士的宁对照品适量，置于25mL量瓶中，加入甲醇适量，超声处理加速溶解，放冷后加甲醇稀释定容至刻度，混匀即得质量浓度均为μg/mL的马钱子碱及士的宁混合对照品溶液。
2.2.2芍药苷对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，置于25mL棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声处理加速溶解，放冷后用甲醇稀释定容至刻度，混匀即得质量浓度为μg/mL的芍药苷对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备精密量取TASS-TGPLLCN1mL，置5mL棕色量瓶中，加入甲醇超声处理30min，并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.4马钱子碱及士的宁色谱条件Agilent型高效液相色谱仪，色谱柱为PhenomenexGiminiC18（mm×4.6mm，5μm），流动相为缓冲盐（0.01mol/L庚烷磺酸钠和0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合，缓冲盐用10%磷酸调pH2.8）-乙腈（79∶21），检测波长为nm，体积流量1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，理论板数应不低于。
2.2.5芍药苷色谱条件Agilent型高效液相色谱仪，色谱柱为PhenomenexGiminiC18（mm×4.6mm，5μm），检测波长为nm，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（14∶86），体积流量1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于0。
2.2.6线性关系考察分别精密量取马钱子碱及士的宁混合对照品溶液、芍药苷对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL置于5mL棕色量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，混匀，取20μL进样，以峰面积积分值为纵坐标（X），质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得芍药苷的回归方程Y＝15.76X＋21.79，r＝0.，马钱子碱的回归方程为Y＝14.11X－19.45，r＝0.，士的宁的回归方程为Y＝20.45X－27.89，r＝0.，线性范围分别为芍药苷4.26～.00μg/mL，马钱子碱2.00～.00μg/mL，士的宁2.00～.00μg/mL。
2.2.7精密度试验按“2.2.4”“2.2.5”项下色谱条件，分别精密量取上述马钱子碱及士的宁混合对照品溶液与芍药苷对照品溶液，连续进样6次，测定3者的峰面积，结果显示马钱子碱、士的宁及芍药苷的峰面积RSD分别为0.19%、0.12%、0.15%，结果表明试验仪器精密度良好。
2.2.8稳定性试验取同一份TASS-TGPLLCN，按照“2.2.3”项下方法处理，分别于0、4、8、10、12h进样检测，结果马钱子碱、士的宁及芍药苷的峰面积RSD分别为1.24%、1.05%、0.60%，结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.2.9重复性试验按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.4”“2.2.5”项下色谱条件检测，结果马钱子碱、士的宁和芍药苷质量浓度RSD分别为1.82%、0.58%及0.83%，结果表明该方法重复性良好。
2.2.10加样回收率试验分别精密量取9份已测定的TASS-TGPLLCN各1mL，置于5mL棕色量瓶中，分别加入相当于样品含量80%、%及%对照品溶液，按“2.2.3”项下方法处理，依法测定，结果显示马钱子碱、士的宁及芍药苷的平均加样回收率分别为93.12%、94.84%、.00%，RSD分别为1.86%、1.92%、1.61%，表明该方法准确度符合要求。
2.3超滤离心法测定TASS-TGPLLCN包封率及载药量
应用一定分子孔径的超滤膜来分离游离药物分子与纳米粒，测定LLCN的包封率[18]。精密量取0.4mLTASS-TGPLLCN置于YM-超滤离心管中，0r/min离心15min。下层滤液为澄明溶液，表明超滤管能把乳白色的LLCN的材料截留。分别精密量取TASS-TGPLLCN和下层液体0.1mL，用甲醇定容至2mL，测定两液中马钱子碱、士的宁及芍药苷的含量，计算包封率。
包封率＝(LLCN药物总含量－游离药物含量)/LLCN药物总含量
载药量＝(脂质立方液晶纳米粒药物总量－游离药物量)/(脂质立方液晶纳米粒包封药物量＋载体材料用量)
2.4单因素考察TASS-TGPLLCN处方
2.4.1载体用量的考察精密称取0.5、1.0、1.5gGMO，按“2.1”项下方法分别制备TASS-TGPLLCN，其包封率结果见表1。实验结果显示，载体用量对马钱子碱、士的宁及芍药苷的包封率影响均较大，尤其是对芍药苷包封率的影响较大，载体用量为1.0g时3者包封率均较高。
2.4.2分散相用量的考察分散相用量分别为40、60、80mL，按“2.1”项下方法分别制备TASS-TGPLLCN，其包封率结果见表2。实验结果显示，分散相用量为60mL时，马钱子碱、士的宁及芍药苷3者的包封率均较高。
2.4.3F用量的考察F用量分别为0.12、0.24、0.36g，按“2.1”项下方法分别制备TASS-TGPLLCN，其包封率结果见表3。实验结果显示，随着F用量的不断增加，马钱子碱、士的宁及芍药苷3者包封率均不断增大。
2.4.4药物用量的考察实验室前期研究显示马钱子与白芍1∶6配伍比例下“减毒增效”效果最佳[5]，因此本实验中TASS与TGP用量比例为1∶3.6（折算成原药材比例为马钱子-白芍1∶6），两者用量总和分别相当于GMO用量的5%、7%、10%、15%、20%、25%。按“2.1”项下方法分别制备TASS-TGPLLCN，其包封率结果见表4。实验结果显示药载比对马钱子碱、士的宁及芍药苷的包封率影响较大，随着投药量的不断增大，3者的包封率均呈上升趋势，但当药载比达到25%时，3者包封率均下降，说明投药量过大时，可能会破坏液晶的内部结构。
2.5均匀设计优化TASS-TGPLLCN处方
2.5.1因素与水平的确定由单因素考察结果可知，药载比（X1）、F用量（X2）及分散相用量（X3）这3个因素对包封率的影响较大，固定GMO用量为1.0g，选取以上3个因素4个水平，采用均匀设计以TASS-TGPLLCN的包封率（马钱子碱、士的宁、芍药苷的包封率分别用Y1、Y2、Y3表示）和载药量（马钱子碱、士的宁、芍药苷的载药量分别用Y4、Y5、Y6表示）为评价指标进行综合加权评分［Y，Y＝(Y1/Y1max＋Y2/Y2max＋Y3/Y3max＋Y4/Y4max＋Y5/Y5max＋Y6/Y6max)/6］，优化TASS-TGPLLCN最优处方工艺。具体因素水平表见表5。
根据U8(83)均匀设计表，将各因素的水平数进行合并：{1,2}＝1′；{3,4}＝2′；{5,6}＝3′；{7,8}＝4′，具体实验安排及实验结果见表6。
2.5.2数据处理通过DPSV7.05数据处理系统，结合实验结果，进行2次多项式逐步回归拟合，获得以下方程：Y＝?11.＋43.X2＋0.X3＋65.X12－66.X1X2－0.X2X3，其中X1为药载比（%），X2为F用量（g），X3为分散相用量（mL），Y为各实验组包封率及载药量的综合评分。回归模型方差分析结果表明，该试验模型具有高度的显著性（P＜0.05），剩余标准差为0.，F值为61.，显著性P值为0.，相关系数（r）＝0.，说明该模型能够很好地反映响应值的变化，拟合度较好。可以用此模型来分析和预测处方结果。
分析自变量和因变量间关系可以得出，X1（药载比）与综合得分呈曲线相关，X2（F用量）及X3（分散相用量）与综合得分呈线性关系。说明药载比、F用量及分散相用量均是影响马钱子碱、士的宁及芍药苷包封率及载药量的主要因素。
2.5.3优化及处方验证通过DPSV7.05数据处理系统的分析结果可知，系统选出的最优组合为GMO用量为1.0g；TASS用量为0.g，TGP用量为0.g，F用量为0.25g，分散相用量为60mL。按照优选的最佳工艺条件重复3次试验，结果见表7。
2.6TASS-TGPLLCN的质量评价
2.6.1pH值平行制备TASS-TGPLLCN3批，分别测定其pH值，结果pH值分别为6.56、6.68、6.63，平均值为6.62，RSD为0.91%。
2.6.2粒径分布取TASS-TGPLLCN适量，用水适当稀释后，用马尔文粒度仪测定粒径分布，具体结果见图2。结果表明制得的纳米粒平均粒径为（.3±16.4）nm，多分散指数（polydispersityindex，PDI）为0.24±0.10。
2.6.3微观形态取TASS-TGPLLCN10μL滴加于铜网上，滴加1.0%的磷钨酸溶液染色，用透射电子显微镜观察，结果见图3。可直观看出TASS-TGPLLCN呈现立方体形态，边界分明，大小均一。
2.7TASS-TGPLLCN凝胶离体经皮吸收行为研究
2.7.1供试品的制备精密称取1.0gGMO于50mL烧杯中，分别加入0.gTASS及无水乙醇溶液20mL，超声处理15min，使其充分溶解，作为A相；精密称取0.25gF于mL烧杯中，分别加入0.gTGP及超纯水60mL，超声15min，使其充分溶解，作为B相；将A相缓缓滴加至B相中，以r/min转速于50℃下磁力搅拌3h，
再于细胞超声破碎仪上超声破碎5min（超声功率为W，5s/次，每次间隔5s），即得TASS-TGPLLCN混悬液，加入25%F，于4℃冰箱中放置过夜，24h后取出，恢复室温，即得TASS-TGPLLCN凝胶。
精密称取0.gTASS，加入1gPEG，玻棒持续搅拌，将0.gTGP适量溶解于双蒸水中，将TGP溶液缓缓滴加入TASSPEG混合液中，持续搅拌，混匀，加入25%F，于4℃冰箱中放置过夜，24h后取出，恢复室温，即得TASS-TGP普通凝胶。
2.7.2离体小鼠皮肤的制备健康雄性KM小鼠，脱颈处死后，剃除腹部毛发，快速分离腹部皮肤，用脱脂棉擦除皮下脂肪组织及粘连物，生理盐水冲洗，滤纸吸干后用铝箔纸包裹，于?20℃冷冻保存，于24h内使用。
2.7.3渗透扩散装置离体透皮渗透扩散装置采用改良Franz扩散池。扩散面积1.85cm2，接收池容积为12mL，恒温水浴温度保持在（37.0±0.5）℃，转速设定为r/min，每次取样量为1mL。
2.7.4累积透过量（Qn）实验剪取面积略大于扩散池表面积的皮肤，置于Franz扩散池供给池与接收池结合处，弹簧夹固定，实验前先用接收液平衡30min后，分别取TASS-TGP凝胶、TASS-TGPLLCN凝胶0.5g均匀地涂抹于皮肤表面，每组平行6份。分别于2、4、6、8、10、12、24h精密移取接收液1mL（每次取样后均补加等量的空白接收液），将取出的接收液于00r/min离心10min，取上清液，HPLC测定马钱子碱、士的宁及芍药苷的含量，并计算Qn。结果见表8。
A为有效扩散面积，V为接收液总体积，Cn为第n次取样时接收液中药物的质量浓度，Vi为取样体积，Ci为第i次取样时接收液中药物的质量浓度
以药物的24h累积透过量（Q24）对取样时间（t）作图，并对曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率，即为稳态透皮速率（Js）。由结果可知，LLCN凝胶和普通凝胶中马钱子碱的Q24分别为1.、0.μg/cm2，Js分别为0.、0.μg/(cm2?h)，士的宁的Q24分别为11.、5.μg/cm2，Js分别为0.、0.μg/(cm2?h)；芍药苷的Q24分别为2.、1.μg/cm2，Js分别0.、0.3μg/(cm2?h)。结果见表9。
2.7.5皮肤滞留量（Qs）试验Q24实验结束后，取下皮肤，生理盐水洗净，将给药部分皮肤剪碎后，加入甲醇1mL，涡旋混合5min后，超声30min，于0r/min离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，测定马钱子碱、士的宁及芍药苷的含量，Qs按Qs＝VC/A（A为有效扩散面积，V为溶解样品体积，C为测得的马钱子碱、士的宁及芍药苷的质量浓度）计算，结果见表9。
3讨论
本实验对TASS-TGPLLCN的制备工艺及处方进行筛选优化，采用前体注入法制备，选取GMO作为载体材料，F作为稳定剂，制得的TASS-TGPLLCN中马钱子碱、士的宁及芍药苷的包封率均大于50%。TASS-TGPLLCN平均粒径为（.3±16.4）nm，粒径分布较均匀。在透射电镜下，TASS-TGPLLCN呈现立方体形态，边界分明，大小均一。采用Franz扩散池法开展TASS-TGPLLCN凝胶与TASS-TGP普通凝胶的体外经皮吸收行为比较。结果表明，液晶凝胶中马钱子碱、士的宁及芍药苷的Qs较普通凝胶组均有所增加，提示立方液晶能增强皮肤贮库效应，有利于药物的持续释放，这与课题组前期开展的马钱子总碱LLCN的制备及体外评价研究结果相吻合[19]。
3.1包封率的测定方法
包封率的测定方法较多，常用的有超滤离心法、透析膜法、葡聚糖凝胶柱色谱法、微柱离心法等，由于TASS及TGP的溶解性质差异较大，采用透析膜法及葡聚糖凝胶柱色谱法难度较大，因此最终选用超滤离心法，该法操作简便快速，适用于TASS-TGPLLCN包封率的测定。
3.2制备及处方工艺考察
前期课题组在预试验过程中，分别对各类载体材料、制备方法、制备工艺参数（搅拌转速、搅拌温度、搅拌时间、超声功率/样品体积比及超声次数）等进行了单因素考察优化。其中搅拌温度及搅拌时间对包封率的影响较大，尤其是对芍药苷的包封率影响极大，分析原因可能是搅拌温度及搅拌时间与处方中无水乙醇是否驱除完全有直接关系，无水乙醇在较低温度及较短时间内驱除不完全，导致包封率较低。但由于温度和光照对芍药苷的稳定性影响较大[20-22]，综合考虑，最终将搅拌温度设定为50℃，搅拌时间确定为3h。
在处方工艺优化过程中，分别考察了载体用量、药载比、F用量及分散相用量对马钱子碱、士的宁及芍药苷包封率及载药量的影响，并运用均匀设计开展处方工艺优化，得到最佳制备工艺处方，马钱子碱、士的宁及芍药苷的包封率均大于50%，达到实验预期。
3.3体外经皮吸收行为比较
本实验采用Franz扩散池法开展TASS-TGPLLCN凝胶与TASS-TGP普通凝胶的体外经皮吸收行为比较，结果显示液晶凝胶能一定程度上增加马钱子碱、士的宁及芍药苷的Qs，在皮肤中形成贮库效应。另一方面，从Q24及渗透速率的变化规律均显示液晶凝胶较大程度促进了马钱子碱、士的宁和芍药苷的经皮渗透。值得注意的是马钱子碱及士的宁的Q24增大可能导致体内吸收增加，应
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